אחת הטכניקות המובילות המשמשת לצפייה בגלאים (probe) ביולוגיים היא מיקרוסקופיית פלואורסצנטית (fluorescence) בהחזרה פנימית מלאה (TIRFM). טכנולוגיה זו מקטינה במידה רבה את הרקע הבלתי רצוי ומאפשרת לקבל דימות של פרוסות אופטיות דקות. שדה נסתר מאיר את משטח הדגימה ואת הסביבה הקרובה אליו בסדר גודל של 100 ננו-מטר בלבד. בעמוד התווך של מיקרוסקופיה מודרנית אנו מוצאים טכניקות של מולקולות בודדות אשר מסייעות להאיר התנהגות מורכבת של מולקולות. תוויות בצבעים שונים מאפשרות לקבל מראות פנימיים מפורטים אף יותר, במיוחד בשילוב עם שיטות מעברי FRET או שיטות של רזולוציית על.
במאמר זה נציג מיקרוסקופ
TIRF רב צבעי המצויד במקור תאורה iChromeMLE (של חברת TOPICAPhotonics) אשר מאפשר לבצע עירור בדגימה בעזרת עד ארבעה ערוצי לייזר נפרדים. נדגים את האפשרות ליישום מכשיר כזה לצורך מדידה של דינמיקה של מולקולה יחידה ולצורך מחקר של תאים שלמים.
מערך הניסוי
בניסוי השתמשנו במקור תאורה מסוג
(איור 1) מחובר למיקרוסקופ
TIRF שבנוי בהתאמה אישית (איור 2, איור 3). בדרגה הראשונה, קרן הלייזר הורחבה באמצעות עדשת כיוון הקבלה-קולימציה- ולאחר מכן, היא הועברה דרך חריר, אשר מבקר את רוחב השדה המואר. בשלב הבא, מיקדנו את קרן הלייזר על מישור המוקד האחורי של עדשת האובייקטיב (Apochromat 100xNA1.49 של Nikon). הזזת הבמה (stage) בכיוון אנכי משנה את המרחק שבין הקרן לבין הציר האופטי של עדשת האובייקטיב. העברת הקרן לכיוון הגבול החיצוני של מישור המוקד האחורי משנה את הזווית שבה הקרניים יוצאות מעדשת האובייקטיב. מעל לזווית מסוימת (“הזווית הקריטית”) מתרחשת החזרה פנימית מלאה בממשק שבין זכוכית הכיסוי לבין הדגימה הנוזלית, וגורמת להתפשטות של שדה נעלם אל תוך הדגימה. מאחר ששדה זה דועך באופן מעריכי (אקספוננציאלי) הוא מאפשר לעורר את החומרים הפלואורופוריים (fluorophore) בתוך פרוסות בעובי של 100 ננו-מטר בערך. עדשת האובייקטיב אוספת את אות הפלואורנות המופרד מעירור הלייזר בעזרת מראה דיכרואית. כתוצאה מכך, הפלואורנות ממוקדת בעזרת עדשה גלילית אכרומטית, בחריר הקדמי של התקן OptoSpiltIII של CairnResearch (המצויד במסנני פליטה 525/36 600/37 676/29), אשר מקרין את שלושת ערוצי הזהירה על חיישן (מצלמה) iXonEMCCD של Andor. התוצאה המתקבלת היא חפיפת צבעים לא אמיתיים (falsecolor) של שלוש תמונות המצלמה ברמות אפור, (לדוגמה, דרך תוכנת עיבוד התמונה ImageJ במחשב אישי).
טכנולוגיית
FRET בצומתי Holliday
כדוגמה לאופן שבו ניסויים בריבוי צבעים יכולים לסייע באיסוף מידע בנוגע לדינמיקה של מולקולות, חקרנו צומתי
Holliday, אך אלו מתוארים במאמר נפרד. צומת Holliday היא תהליך ביניים בהצרפה גנטית (recombination) שבו שני סלילים הומולוגיים מתחברים לצורך החלפת מידע גנטי. הצורון הרגעי
(conformation) בשלב ההפרדה קובע את הכמות של המקטעים המוחלפים.
כדי ליצור מבנה רביעוני (quadruplex) אופייני של צומת Holliday, ביצענו הכלאה (hybridization) של ארבעה גדילי DNA. סימנו כל אחד מהשלושה מבין גדילי DNA באמצעות מולקולת צבע Alexa 488, ATTO565 ו-ATTO647N בהתאמה, ולגדיל הרביעי חיברנו ביוטין אשר עיגן את המבנה אל משטח זכוכית הכיסוי (איור 4). הוספה של 150 מילי-מול מגנזיום כלורי (MgCl) השרתה פעולות פאי ארומטיות (stacking) לפי זוגות והיפוך (flipping) של הסלילים. הוספנו 1 מילי-מול של חומצה אסקורבית ו-1 מילי-מול של מתילוויולוגן (methylviologen) כרכיבי חימזור (חימצון-חיזור), אשר שניהם פעלו כמייצבים באור (photostabilizer). על מנת לזהות את השבר של צומתי Holliday המורכבים באופן מלא הארנו את הדגימה באמצעות שלושה מקורות לייזר בו זמנית (488 ננו מטר, 561 ננו מטר, 640 ננו מטר) של מקור התאורה iChromeMLE (עיין באיור 5, בחלק העליון). באופן כזה יצרנו עירור של כל שלושת הצבעים וזיהינו אותן נקודות שבהן הופיע אות של פליטה חזקה בכל שלושת הערוצים. לאחר מכן הארנו את הדגימה במקור לייזר של 488 ננו מטר בלבד וביצענו רישום של אותות הפלואורנות בכל שלושת הערוצים באמצעות חיישן EMCCD עם זמן אינטגרציה שווה ערך ל-20 הרץ (עיין באיור 5 בחלק התחתון).
במערכת, הפועלת עם מעברי
FRET , Alexa488 המעורר (התורם) מעביר את האנרגיה אל ATTO565 (קולט) או אל ATTO647N (קולט). ואולם, נצילות ההעברה תלויה במידה רבה במרחק שבין שני חומרי הצבע (). אם שני חומרי הצבע נמצאים בקרבה גדולה, הנצילות של מעבר FRET בין שני חומרי צבע אלו תהיה גבוהה ואפשר יהיה לקלוט ולבצע רישום של אות פלואורנות חזק מ-ATTO565. באותה העת, ATTO647N יימצא במקום הרחוק ביותר מהתורם. בצורון השני, המצב הפוך: ATTO565 יימצא במקום הרחוק ו-ATTO647N יהיה ממוקם סמוך ל-Alexa 488. מעבר FRET יתקיים בין Alexa 488 לבין ATTO647N. בהשוואה לתצורת Alexa 488 עם ATTO565, יש בתצורה Alexa 488 עם ATTO647N פחות חפיפה ספקטרלית (איור 6), ולכן נצילות מעברי FRET שביניהם תהיה נמוכה יותר. ועם זאת, הדינמיקה של האותות מאפשרת להעריך את מצב המולקולות של צומת Holliday בשני הצורונים. דוגמה לפליטה בתצוגת זמן של המולקולות בשלושת הצבעים נתונה באיור 7.
מאחר ש-
iChromeMLE מאפשר בנוסף גם לבצע מיתוג מהיר בין ערוצי הלייזר (עד 20 מגה הרץ), אפשר לממש שיטה של עירור לייזר מתחלף. טכניקה זו מאפשרת ניתוח נוסף ומפורט יותר של רמות הנצילות של מעברי FRET.
טכניקת פלואורנות
TIRF בתאים צבועים טכניקת פלואורנות TIRF מתאימה היטב לניתוח של תהליכים בתאים, בקרבת קרום התא. טכניקה זו מקטינה עד למינימום את רעש הרקע, למשל מהציטופלזמה, ובכך משיגה ניגוד גדול יותר מאשר בטכניקות אחרות. יכולת הצגה של הרכיבים הבדידים בערוצי הצבע השונים נדרשת במיוחד כאשר מעורבים רכיבים מרובים בתהליך שאותו חוקרים. באיור 8 מוצגים תאי HEK-293 צבועים (stained) בריבוי צבעים (תאי כליות עובריים אנושיים) כפי שהם נראים במיקרוסקופ.
ביצענו קיבוע (fixation) באמצעות פורמלין (formaldehyde) ויצרנו חדירות (permeabilize) של התאים באמצעות TritonX-100. קורי האקטין נצבעו בחומר הצבע טטרה מתיל רהודאמין (tetramethilrhodamine) שעבר שינוי בחיבור ל- (Sigma-Aldrich), אשר עובר עירור באמצעות מקור לייזר של 561 ננו מטר. השתמשנו ביודיד TO-PRO-3 (של Invitrogen) כצבע ניגוד עבור הגרעין (העירור הוא ב-640 ננו מטר). כצבע שלישי, תאי HEK-293 ביטאו ביטוי כפול של YFP – חלבון זוהר צהוב (עירור ב-488 ננו מטר) עם פרסטין בקרום התא הצדדי.
ערכנו צילומים של תמונות תאים על משטח זכוכית הכיסוי באמצעות חיישן המצלמה iXonEMCCD של Andor והעברנו אותם תהליך עיבוד למען שיפור הבהירות והצבע בתוכנת ImageJ. תרומות הצבע של הגרעין, האקטין והפרסטין, שניתן להבחין בהן היטב, מאפשרות מיפוי של הפיזור של רכיבים אלו (איור 8).
הכתבה נמסרה באדיבות חברת להט טכנולוגיות בע”מ
מאת : P. Meyer, M. StrackharnS. Baumann, Ludwig-Maximilians-Universität & München M. Lang TOPTICA Photonics AG, Gräfelfing
