הפיזיקה של היסט פיקסלים

מאת: ד”ר פראשאנט פראבאט | ד”ר טוראן ארדוגאן

הפיזיקה של היסט פיקסלים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית

1. מבוא

במיקרוסקופיה פלואורסצנטית רב-צבעית, היסט פיקסלים יכול לגרום לשגיאות דימות, שיכולות להוביל לפירוש שגוי של נתונים ביולוגיים [1]. מאמר זה מדגיש כמה שיקולי מפתח בתכנון של מערכי מסננים אופטיים עם ביצועי “היסט פיקסלים אפס” (שגיאה של פחות מפיקסל אחד).

2. הפיסיקה של היסט פיקסלים

מסננים אופטיים הם בדרך כלל הרכיבים היחידים במערכת דימות שמשתנים כאשר נוצרת תמונה סדרתית מורכבת. הפגם העיקרי במסננים אופטיים שגורם להיסט פיקסלים הוא סטייה של הקרן, שנוצרת על ידי זווית טריז שאינה אפס (אי מקבילות) של מסנן מפצל האלומה הדיכרואי ו/או מסנן הפליטה, משום ששני המסננים האלה נמצאים במסלול הדימות (ראה איור 1). שינוי במקביליות של המסננים במערכי המסננים הקשורים לצבעים שונים גורם להטיה של קרני הפליטה השונות במידות שונות, ובכך ליצירת היסט פיקסלים בין המיקומים של הצבעים השונים בתמונה המורכבת (ראו הדגמות נוספות ב- [1]).

אפשר להסביר את הפיזיקה שבבסיס היסט הפיקסלים על ידי התבוננות בסטיית הקרן בזכוכית בצורת טריז. כשקרן אור נעה דרך לוח זכוכית שהמשטחים שלו אינם מקבילים באופן מושלם, הכיוון של הקרן היוצאת מוסט, והוא כבר לא מקביל לכיוון של הקרן הפוגעת. סטייה של קרן הנגרמת על ידי טריז מצע  תלויה בזווית הפגיעה θ, מקדם השבירה של חומר המצע N והזווית של טריז המצע α. איור 2 מדגים באופן סכמטי סטייה של קרן דרך טריז מצע. הסטייה הכוללת של הקרן (β) נתונה על ידי

 (1)    

(2)

כש-θ = 0 ו-α מאוד קטנה, אפשר לפשט את התוצאה שלעיל כך:

(3) 

לכן, סטיית הקרן תלויה בבירור בזווית של טריז המצע α ומושפעת גם מהכיוון של המסנן ביחס לקרן הפוגעת θ. אולם, יש לשים לב ממשוואה 2 שעבור זווית טריז מצע α נתונה, סטיית הקרן β ניכרת יותר בזוויות פגיעה θ גבוהות יותר (ראו גם איור 3). היות שמפצל הקרן הדיכרואי ממוקם בדרך כלל בזווית של 45 מעלות, לטריז מצע נתון הדיכרואי מפיק סטיית קרן גדולה יותר בהשוואה למסנן פליטה (שבדרך כלל ממוקם בזווית של כחמש מעלות).

מהתלות של סטיית הקרן בזווית θ עולה גם שהשתנות הזווית של כל אחד מסוגי המסננים מהזווית האידיאלית (45 מעלות בדיכרואים ובדרך כלל חמש מעלות בפולטים) בין קוביות עשוי לגרום להיסט פיקסלים גדול יחסית. אולם, ההשפעה הזאת זניחה משום שכדי שהמיקרוסקופ ישמור על פעולה תקינה הזווית של המסנן הדיכרואי צריכה להישמר קרוב למדי ל-65 מעלות, ולכיוון של מסנן הפליטה יש השפעה זניחה על היסט פיקסלים (איור 3).

הסטייה של הקרן גורמת למעשה להסטה של חזית הגל המועבר מכיוון ההתקדמות של חזית הגל הפוגע (איור 4). חוץ מהיעדר המקביליות של שני המשטחים המנוגדים של המסנן הדיכרואי ושל מסנן הפליטה, גם העיקום של המסנן יכול להשפיע על סטיית הקרן (איור 4C). מפצל קרן דיכרואי עקום שממוקם במסלול הפליטה של מיקרוסקופ יכול ליצור סטיית קרן שגורמת להיסט פיקסלים. לצורך הניתוח, עם זאת, אפשר להראות שסטיית הקרן בגלל עיקום ניתנת לביטוי באופן שקול על ידי סטיית קרן בגלל טריז מצע.

בניגוד לדעה שמקובלת באופן נרחב, העובי הלא אפסי של מפצל הקרן הדיכרואי לא אמור לגרום להיסט פיקסלים במיקרוסקופ אידיאלי שיש בו עצמיות עם תיקון לאינסוף ועדשת צינור. הקרן שעוברת דרך המסננים מוקבלת, וכך הקרן שיוצאת מדיכרואי, למרות שהיא קצת מוסטת רוחבית במידה שהיא פרופורציונלית לעובי של הדיכרואי, מקבילה לקרן הפוגעת. בהתאם לאופטיקה מהסדר הראשון (קירוב טוב במקרה זה), היסט רוחבי במסלול הקרן לא יוצר היסט פיקסלים ניכר. אולם, אם האור שמועבר דרך הדיכרואי הזוויתי מתכנס או מתבדר, אז אפילו דיכרואי מקביל באופן מושלם גורם להיסט ניכר של התמונה במצלמה. לכן, צריך להקפיד לא למקם דיכרואי בין עדשת הצינור והמצלמה.

3. התיאוריה של תכנון מערך מסננים  “עם היסט פיקסלים אפס”

כדי לתכנן מערך מסננים  “עם היסט פיקסלים אפס”, סטיית הקרן שנובעת משגיאת הטריז צריכה להיות קשורה למידה של היסט הפיקסלים. במצלמת CCD, היסט פיקסלים במישור התמונה מתואר על ידי:

 

כאשר pixel _ shift הוא ההיסט במספר הפיקסלים, β היא סטיית הקרן נטו מהצמד הדיכרואי והפולט, fTL הוא אורך המוקד של עדשת הצינור ו-pixel _ size הוא ריווח הפיקסלים מרכז למרכז של מצלמת ה-CCD.

במיקרוסקופ עם עדשה צינורית עם אורך מוקד 200mm ומצלמת CCD עם גודל פיקסל של 6.7μm, סטיית קרן נטו של 6.9 שניות קשת גורמת להיסט פיקסלים כולל של פיקסל אחד (על סמך משוואה 2). לכן דוגמה של “היסט פיקסלים אפס” היא הדרישה שסטיית הקרן נטו ממערך המסננים תהיה פחות מ-6.9 שניות קשת. במצלמות מסוימות, עם זאת, הגודל של הפיקסל יכול להיות הרבה יותר מ-6.7μm, או גודל הפיקסל האפקטיבי יכול להיות גדול יותר בגלל איחוד פיקסלים (binning), ולכן הדרישות עשויות להיות הרבה פחות מחמירות (ראו איור 5).

 הוא הסכום הווקטורי של היסטי הפיקסלים   ו-  , התרומות הפרטניות להיסט הפיקסלים מהדיכרואי והפולט בהתאמה. כדי להשיג ביצועי “היסט פיקסלים אפס”, .

למונח “היסט פיקסלים” יש משמעות רק כשהוא מוגדר יחסית לנקודה בתמונת ייחוס. במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, בדרך כלל כל אחת מקבוצה של תמונות פלואורסצנטיות חד-צבעיות נחשבת לתמונת הייחוס. לכן, כדי להשיג ביצועי “היסט פיקסלים אפס”, מספיק שהמיקום של התמונה מוסטת הפיקסלים של מקור נקודתי (לדוגמה, הנקודה הירוקה הרחוקה מראשית הצירים באיור 6) לא מוסט ביותר מפיקסל אחד יחסית למיקום של תמונת הייחוס (הנקודה הירוקה בראשית הצירים באיור 6). כפי שמראה ציור 6, גבול המפרט של “היסט פיקסלים אפס” של סמרוק מתאים למעגל ברדיוס של פיקסל אחד (ראו גם פרק 5). מבחינה מתמטית, אפשר לבטא את הקריטריון הזה כך:

 

כאשר

 

כאן  הוא וקטור שמייצג את היסט הפיקסלים נטו, שמורכב  מהתרומות הפרטניות של הדיכרואי והפולט,  ו-  ,  בהתאמה. היות שהכיוונים של הטריז וגם של המסננים עצמם יכולים להיות אקראיים בקוביית במסנן, התרומות הפרטניות להיסט הפיקסלים יכולות להעצים או אפילו לבטל את ההיסט נטו, ולכן נחוץ חיבור וקטורי.

4. ייצור  מערך מסננים “עם היסט פיקסלים אפס”

בגלל המגבלות של השיטות המסורתיות לייצור מסננים, כגון טכנולוגיית מסננים עם ציפוי רך המבוססת על קרן אלקטרונים או אידוי תרמי, היה קשה לייצר מערכי מסננים “עם היסט פיקסלים אפס”. בגלל שהפולט היה מבוסס על  מצעים מרובים המרובדים ביחד (איור A7), היה כמעט בלתי אפשרי להשיג זווית טריז נמוכה ללא עיבוד נוסף של המסנן המוגמר. צריך היה לבחור בקפידה זוגות של מסננים פולטים ודיכרואים עם סטיות קרן דומות, ולאחר מכן המסננים כוונו בקפידה אחד יחסית לאחר בקוביית מסננים כך שסטיות הקרן של שני המסננים התבטלו (איור B7).

יתר על כן, אחרי שהמסננים כוונו בקפידה, רק יצרן המסננים יכול להוציא אותם מהקובייה או להחליף אותם. הגישה הזאת לתיקון השגיאה של היסט פיקסלים מוכתבת בעיקר על ידי המגבלות של תהליך הייצור עצמו משום שקשה לשלוט בזווית הטריז במסננים אופטיים עם פילם דק רב שכבתי. משמעות נוספת של השליטה הגרועה על זווית הטריז במסננים עם ציפוי רך היא שמערכי מסננים שהם לא “עם היסט פיקסלים אפס” יכולים לגרום לשגיאה של כמה פיקסלים.

עם המצאתן של הטכנולוגיות המודרניות לייצור מסננים פלואורסצנטים עם ציפוי קשה, כמו הטכניקה של התזת קרן יונים (IBS) שפיתחה סמרוק, נעשה אפשרי לייצר כל מסנן עם מצע אחד (איור A8), ובכך להבטיח זווית טריז קטנה של המסננים פשוט על ידי כך שמתחילים עם מצעים איכותיים לפני הריבוץ של הציפוי האופטי. היות שסטיות הקרן שקשורות לדיכרואים ופולטים עם ציפוי קשה הן הרבה יותר קטנות מאשר אלה של מסננים עם ציפוי רך, אפשר להשיג מפרטי “היסט פיקסלים אפס” ללא צורך בהתאמה קפדנית של הכיוונים של הדיכרואים והפולטים (איור B8). לכן, לא נחוצים כיוון או הרכבה מיוחדים כדי להתקין את המסננים בקובייה, והמשתמש במיקרוסקופ יכול למלא את הקוביות בעצמו ולהחליף מסננים בכל עת לפי רצונו.

5. דיון

כפי שנאמר לעיל, במיקרוסקופיה פלואורסצנטית רב-צבעית, מפרט “היסט פיקסלים אפס” של מסנן משמעו בדרך כלל שלא יובחן היסט פיקסלים ניכר בין התמונות שנרכשות מפלואורופורים שונים כאשר משתמשים בקוביות מסננים שונות לצבעים שונים. אולם, מפרט “היסט פיקסלים אפס” לא בהכרח אומר שאין היסט פיקסלים ניכר בין התמונות הפלואורסצנטיות ותמונת שדה בהיר, או תמונה שנרכשה ללא מסננים פלואורסצנטים במסלול הפליטה (מצוין כמיקום “אידיאלי” באיור B8).

היות שהמאמץ העצמותי של שכבות הפילם הדק במסנן עם ציפוי קשה יכול להיות שונה מזה של המצע, עשוי להיגרם כיפוף (או עיקום) של המצע. העיקום הזה מהווה בעיה במיוחד לגבי הדיכרואי, והוא יוצר סטיית קרן וכתוצאה מכך היסט פיקסלים שהוא תמיד באותו הכיוון במצלמת ה-CCD. כפי שמוזכר לעיל, “היסט קבוע” זה באיור B8 בגלל הכיפוף של הדיכרואי קיים בכל המסננים הסטנדרטיים עם ציפוי קשה, אלא אם כן הוא תוקן באופן ספציפי. אפשר אמנם “לשטח” את הדיכרואי (כלומר, לבטל את הכיפוף) על ידי הוספת ציפוי מאזן על המשטח הנגדי של הדיכרואי, אבל הגישה הזאת גורמת לתוספת עלות ניכרת. כדי לספק את הפתרון הכי משתלם, הגבול של מפרט “היסט פיקסלים אפס” של סמרוק מוגדר ביחס למיקום של תמונת הייחוס, שמוסט מראשית הצירים (“מיקום אידיאלי” באיור B8) על ידי מרחק שמסומן “היסט קבוע” באיור B8. הכיוון של הווקטור הזה תמיד קבוע (כלומר, ידוע) משום שהכיוון של המשטח המצופה והמחזיר של הדיכרואי ידוע. וכן, היות שתהליך הייצור של סמרוק ניתן לחזרה במידה רבה, האורך של הווקטור מושאר קבוע לטולרנס גבוה מאוד בכל הדיכרואים הסטנדרטים עתירי הביצועים עם פס אחד.

יש לציין שעדיין אפשר להשיג ביצועי “היסט פיקסלים אפס” כשעושים דימות פלואורסצנטי ושדה בהיר בו-זמני על ידי התאמה בין סטיית הקרן בנתיב הדימות של השדה הבהיר וסטיית הקרן בנתיב האור של הדימות הפלואורסצנטי. אפשר לעשות את ההתאמה באמצעות קוביית מסננים “עם היסט פיקסלים אפס” שדה בהיר מיוחדת שמוכנסת במסלול ההעברה של דימות השדה הבהיר (ראו את המערך BRFLD-A-000-ZERO של סמרוק).

היות שגישת התכנון למערך מסננים “עם היסט פיקסלים אפס” יכולה להיות שונה על בסיס טכניקות הייצור השונות, מערכי מסננים “עם היסט פיקסלים אפס” מיצרנים שונים בדרך כלל לא תואמים זה לזה. לדוגמה, “ההיסט הסטנדרטי” יכול להיות שונה אצל יצרנים שונים. לכן, אפשר שיהיה נחוץ תיקון היסט פיקסלים מבוסס תוכנה כאשר משתמשים במערכי מסננים מיצרנים שונים ביחד.

גם פגמים בהרכבה של קוביית המסננים תורמים במידה מסוימת להיסט פיקסלים. באופן כללי, ההשפעה הזאת אינה משמעותית מספיק כדי ליצור היסט פיקסלים ניכר כשהקובייה מורכבת באופן נכון. למרות זאת, מרווח השגיאה של הרכבת הקובייה מובא בחשבון בקביעת גבול המפרט של “היסט פיקסלים אפס” (סעיף 3).

בייצור בכמויות גדולות, המפרטים בדרך כלל נוצרים על סמך דגימה סטטיסטית של מספר גדול של רכיבים. לדוגמה, המיקום של תמונת הייחוס באיור B8 מתאים למיקום של הממוצע של המיקומים של התמונות “מוסטות הפיקסלים” של מספר גדול מאוד של מסנני סמרוק. מהתבוננות באיור B8, אפשר לראות שתיאורטית יש אפשרות שהשגיאה היחסית במערכי מסננים “עם היסט פיקסלים אפס” תהיה יותר מפיקסל אחד (אפילו עד שני פיקסלים). אולם, ההסתברות של השגיאה הזאת היא נמוכה מאוד, משום שהיא מתרחשת רק שהכיוונים של הווקטורים    של שתי הקוביות מנוגדים זה לזה באופן מדויק והאורך שלהם זהה בדיוק. לכן, בחירת גבול מפרט של “היסט פיקסלים אפס” (באיורים 6 ו-8) של חצי פיקסל בלבד תהיה בעצם תכנון יתר בהתחשב בהשתנות הסטטיסטית של הייצור.

לבסוף, כל תכנון טוב רק כמו ההנחות שבבסיסו. העיקרון הזה חל גם על התכנון של מערכי מסננים “עם היסט פיקסלים אפס”. לדוגמה, במערכי המסננים “עם היסט פיקסלים אפס” של סמרוק מניחים שריווח פיקסלים של הגלאי הוא 6.7μm, ואורך המוקד של העדשה הצינורית הוא 200 mm. ההנחות האלה מבוססות על העובדה שלחלק משמעותי ממערכות הדימות הפופלריות (והמתקדמות) יש מפרטים דומים לאלה. אבל כפי שמראה משוואה (3), ערכים שונים משמעותית של ריווח הפיקסלים ואורך המוקד של העדשה הצינורית בכל תצורה נתונה של מיקרוסקופ יגרמו למספר שונה של פיקסלים (או חלק של פיקסל) הקשורים להיסט פיקסלים.

6. מקורות

[1] P. Prabhat and T. Erdogan, “Pixel Shift in Fluorescence Microscopy,” Semrock White Paper Series, www.semrock.com, 2011.

המחברים

ד”ר פראשאנט פראבאט הוא מדען יישומים וד”ר טוראן ארדוגאן הוא מייסד משותף וסמנכ”ל טכנולוגיות בחברת סמרוק, חטיבה של חברת IDEX.

הכתבה נמסרה באדיבות חברת להט.