מיקרוסקופ TIRF מרובה-צבעים כינון תוך שימוש ב-iChrome עבור ניסויי FRET ו-TIRF

ממיקרוסקופיה פלואורסנטית בעלת החזרה פנימית כוללת (Total internal reflection fluorescence microscopy -) היא אחת הטכניקות המובילות לחקר מדידות ביולוגיות. היא מקטינה מאוד רקע בלתי-רצוי ומאפשרת הדמיה של קטעים אופטיים דקים. שדה חולף (evanescent) מאיר את משטח הדגימה ואת סביבתו הקרובה בסדר גודל של 100 ננו-מטר בלבד. טכניקות בעלות פרודה יחידה המסייעות להאיר התנהגות פרודתית מורכבת מהווים עמוד המיקרוסקופיה החדישה. תוויות בעלות צבע שונה מאפשרות מבט אף מפורט יותר, במיוחד בשילוב עם שיטות FRET או על-רזולוציה.

אנחנו מציגים כאן מיקרוסקופ TIRF מרובה-צבעים המצויד ב- (TOPTICA Photonics) המאפשר לעורר את הדגימה עם עד ארבעה קווי לייזר שונים. אנחנו מוכיחים את היישומיות של מכשיר כזה למדידת דינאמיקה חד-פרודתית ולמחקר על תאים שלמים.

כינון הניסוי
ה- (איור 1) משולב במיקרוסקופ TIRF בנוי לפי צרכי המשתמש (איור 2, 3).  בשלב ראשון קרן הלייזר מורחבת בעזרת עדשה ממרכזת ולאחר מכן היא מועברת דרך פתח, המבקר את רוחב השדה המואר. לאחר מכן הלייזר ממוקד במישור המוקד האחורי של האובייקטיב (Nikon Apochromat 100xNA1,49). הזזת השלב בכיוון אנכי משנה את המרחק בין הקרן והציר האופטי של האובייקטיב. הזזת הקרן אל ההיקף (הפריפריה) של משטח המוקד האחורי משנה את הזווית בה הקרן יוצאת מהאובייקטיב. מעל זווית מסוימת (“זווית קריטית”) מופיעה החזרה מלאה בממשק בין כיסוי הזכוכית והדגימה המימית, והשדה החולף מתרחב לתוך הדגימה. מאחר ששדה זה יורד בצורה מעריכית (אקספוננציאלית) הוא מאפשר עירור הפלואורפורים (fluorphores) בחתך בעובי של כ-100 ננו-מטר. האובייקטיב קולט את האות הפלואורסנטי המופרד מעירור הלייזר בעזרת מראה “דיכרואית” (Chroma zt405 / 488 / 561 / 640rpc). הפלואורסנטיות ממוקדת לאחר מכן בעזרת עדשת שפופרת אכרומטית אל פתח המבוא של ה-Cairn Research OptoSplitIII (המצויד במסנני פליטה 525/35, 600/37, 676/29) המטיל את שלושת ערוצי הפלואורסנציה אל ה-Andor iXon EMCCD. התוצאה היא רובד בעל צבע כוזב של שלוש תמונות המצלמה האפורות (לדוגמה דרך תוכנת עיבוד התמונה ImageJ על PC).

FRET בצמדי Holliday
לשם דוגמה כיצד ניסויים מרובי-צבעים עשויים לסייע להשיג מידע אודות הדינאמיקה של פרודות, חקרנו צמדי Holliday כמתואר במקום אחר1. צמד Holliday הוא תהליך ביניים בהיתאחות (recombination) גנטית, בה שני סלילים כפולים הומולוגיים (homologue double helices) מתאחדים כדי להחליף מידע גנטי. התואמנות (conformation) בעת ההפרדה קובעת את פריסת הקטעים המוחלפים.  אנחנו הפכנו להיברידים ארבעה מוליכים של DNA כדי ליצור את הצורה המרובעת (quadruplex) האופיינית של צמד Holliday. שלושה ממוליכי ה-DNA סומנו בפרודת צבע כל אחד, Alexa488, ATTO565 ו-ATTO647N בהתאמה. אל המוליך הרביעי צירפנו ביאוטין (biotin), אשר עוגן את המבנה אל המשטח כיסוי הזכוכית (איור 4). תוספת של 150mM של MgCl2 גרמה לעירום (stacking) של הזוג ודפדוף (flipping) של הסליל. בתור מרכיבי redox הוספנו 1mM של חומצה אסקורבית ו-1mM של methylviologen אשר שניהם פועלים בתור מייצבי תמונה (photostabilizers). כדי לזהות את מידת צמדי ה-Holliday המורכבים בשלמותם. הארנו את הדגימה בשלושה לייזרים (488nm, 561nm ו-640nm) של ה-MLE iChrome ביחד (ראה איור 5, למעלה). כך אנחנו גירינו את כל שלושת הצבעים וזיהינו את הנקודות בהן הופיע אות שידור חזק בכל שלושת הערוצים.  אנחנו הארנו את הדגימה בלייזר ה-488nm בלבד ורשמנו את אותות הפלואורסנטיות בכל שלושת הערוצים עם ה-EMCCD בזמן שילוב של 20 הרץ (ראה איור 5, למטה). בתור פועלת במערכת FRET, ה-Alexa488 המגורה (תורם) מעבירה את האנרגיה או אל ה-ATTO565 (נוטל) או אל ה-ATTO647N (נוטל). אולם, יעילות ההעברה תלויה מאוד במרחק בין הצבעים . אם צבעי ה-ATTO565 וה-Alexa48 קרובים ביותר, יעילות ה-FRET בין שני צבעים אלה היא גבוהה וניתן לרשום אות פלואורסנטית חזקה מה-ATTO565. באותו הזמן, ה-ATTO647N הוא המרוחק ביותר מהתורם.  בתואמנות השנייה, המצב מתהפך: ה-ATTO565 הוא מרוחק וה-ATTO647N הוא על-יד ה-Alexa488. כך ש-FRET מופיע בין ה-Alexa488 וה-ATTO647N. בהשוואה ל-Alexa488 ו-ATTO565, ל-Alexa488 ו-ATTO647N יש פחות חפיפה ספקטראלית (איור 6), כך שיעילות ה-FRET שלהם היא יותר נמוכה. בכל זאת, דינאמיקת האות מאפשרת הערכה של המצב הפרודתי של צמד ה-Holliday בשתי התאמנויות. דוגמה של הפליטה המותנית בזמן של שלוש פרודות הצבע נתונה באיור 7.  מאחר שה- מאפשר יתר-על-כן מיתוג מהיר בין קווי הלייזר (עד 20 מגה-הרץ), ניתן לממש סכימת עירור לייזר חלופית ALEX)2). טכניקה זו מאפשרת ניתוח נמשך ומפורט יותר של יעילויות ה-FRET.

TIRF בתאים מוכתמים
TIRF מתאימה מאוד לניתוח של תהליכים תאיים סמוך לקרום הפלסמה. טכניקה זו ממזערת את רעש הרקע, לדוגמה מה-cytoplasm, ומשיגה בכך קונטרסט גבוה יותר בהשוואה לטכניקות אחרות. 3 במיוחד כאשר רכיבים מרובים מעורבים בתהליכים הנחקרים, דרושה הדמיה של הרכיבים הפרטיים בערוצי הצבע השונים. איור 8 מראה תאים רב-צבעיים מוכתמים HEK-293 (כליה עוברית אנושית) במיקרוסקופ. אנחנו ביצענו קיבעון (fixation) עם formaldehyde וחדירות מגנטית (permeability) של התאים עם Triton X-100. נימות הלהט (filaments) מ-actin הוכתמו עם tetramethylrhodamine modified phalloidin conjugate () המעורר על-ידי הלייזר של 561 ננו-מטר. השתמשנו ב-TO-PRO-3 iodide כנוגד-כתמים עבור הגרעין (עירור ב-640 ננו-מטר). ובתור צבע שלישי התאים HEK-293 ביטאו ביחד YFP (עירור 488 ננו-מטר) עם prestin בכרום הרוחבי. תמונות מהתאים על משטח של כיסוי זכוכית (coverslip) נלקחו עם ה-EMCCD iXon של Andor ועובדו לאחר מכן עבור בהירות וצבע ב-ImageJ. תרומות הצבע הבולטות יפה של הגרעין, ה-actin וה-prestin מאפשרות מיפוי של חלוקת רכיבים אלה (איור 8).

היתרונות של ה-iChrome MLE עבור TIRF/FRET
טכנולוגיית COOLAC: אין כיול מחדש ידני
מערכת קומפקטית עם הספקת סיב
שילוב נוח בשל הממשק הגמיש
פעולה ללא-ידיים
ספקי מוצא גבוהים צמודי סיב
מיתוג מהיר בין קווי הלייזר

הכתבה נמסרה באדיבות חברת להט טכנולוגיות

1B. Person, I. H. Stein, C. Steinhauer, J. Vogelsang, P. Tinnefeld, ChemPhysChem 2009, 10, 1455-14
2Kapanidis, A. N.; Lee, N. K.; Laurence, T. A.; Doose, S.; Margeat, E.; Weiss, S. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101, 8936
3A. L. Mattheyses, S. M. Simon, J. Z. Rappoport, Journal of Cell Science 2010, 123, 3621-3628