מאת: שבט מסיקה, בן משה
קדמה להדמיה דיגיטלית במיקרוסקופ
מושגי הדמיה בסיסיים
במשך מרבית המאה העשרים, השתמשו מדענים באמולסיה כימית רגישה לאור לצורכי צילום ושחזור הדמיות ממיקרוסקופ אופטי. בסוף המאה העשרים, שיפורים במצלמה האלקטרונית ובטכנולוגית המחשב איפשרו צילום דיגיטלי מהיר יותר, זול יותר והרבה יותר מדויק מהצילום הקונבנציונלי. תחום רחב של טכניקות חדשות שהתפתחו לאחרונה, מאפשרות לחוקרים לחדור עמוק יותר אל תוך הרקמות ולהתבונן בתהליכים ביולוגיים מהירים יותר בתאים חיים, וכך להשיג מידע כמותי במרחב ובזמן ברמה של מולקולה בודדת.
התקני הדמיה הם מהמרכיבים החשובים ביותר במיקרוסקופיה אופטית, מכיוון שהם מאפשרים לקבוע כבר בשלב הדגימה, מבנה רלוונטי ואו דינמיקה של תהליכים לצרכי הצגה ושמירה בזכרון.
שיטות זיהוי של קרינת אור והמגוון הרחב של התקני ההדמיה הזמינים למשתמש במיקרוסקופ, עושים את תהליך בחירת הציוד מורכב ואף מבלבל.
הדיון הזה מנסה לסייע בהבנה של יסודות זיהוי האור, תכונות בסיסיות של התמונות הדיגיטליות והקריטריונים הרלוונטים לבחירת גלאי מתאים ליישומים ספציפים.
פרספקטיבה היסטורית
שימור דמות ממיקרוסקופ מתוארכת כבר לימים הראשונים של המקרוסקופיה.
מכשירי עדשה אחת שפותחו ע”י מדענים הולנדים בסוף המאה ה- 17 אפשרו אילוסטרציות מפורטות של דם, מיקרו אורגניזמים ודגימות זעירות אחרות. המדען הבריטי רוברט הוק בנה את המקרוסקופ המורכב הראשון שהיה הבסיס לעבודתו המונומנטלית “מיקרוגרפיה”, שהתפרסמה ב- 1665 והיא סימן ההיכר שלו במיקרוסקופיה והדמיה. המיקרוסקופים אשר התפתחו במשך תקופה זאת לא היו מסוגלים להקרין תמונות, והתצפית בהם הייתה מוגבלת לראייה קרובה של דגימות דרך עינית המקרוסקופ.
וויליאם הנרי פוקס טלבוט היה הראשון שקבל תמונות מצולמת ממיקרוסקופ כבר ב- 1835, בעזרת שמוש באמולסיות כימית רגישות לאור שהתחילו אז להתפתח. תהליכים אלו קבלו תנופה מואצת ב- 150 השנים הבאות בעקבות השמוש הנרחב בפילמים למצלמות. בסוף המאה ה- 19 ובתחילת המאה ה- 20 קרל זייס וארנסט אבה פתחו זכוכיות אופטיות איכותיות, שמצאו שמוש נרחב במכשור אופטי, כולל מקרוסקופים מורכבים והצעידו משמעותית את טכניקת ההדמיה האופטית.
ב- 1909 דוקטוראנט צרפתי בשם ז’אן קומונדון הציג לראשונה סרטון של פעילות ביולוגת דינמית כפי שנצפתה מבעד לעינית המקרוסקופ. טכניקה זו שוכללה ובשלביה המתקדמים הופיעו מקרוסקופים עם עינית שלישית למצלמת ווידאו. בעשור האחרון של המאה ה- 20 מצלמות ווידאו שפופרת וואקום פינו את מקומן לטובת מצלמות מצב מוצק (CCD) והופיעו טכניקות הדמיה חדשות, שמשלבות שימוש במחשבים.
הדמיה דיגיטאלית: המרה אנלוגית לדיגיטאלית
בלי קשר אם אור מדגימה כלשהיא פוגע ברשתית האדם, בסרט אמולסיה, במסך זרחני, במערך פוטודיאודי של CCD או בכל משטח אחר רגיש לאור, התמונה המתקבלת היא תמיד אנלוגית רציפה. לרוע המזל אנלוגית היא לא שפה שהמחשב יודע לתקשר בה. המחשב יודע לתקשר רק בשפה דיגיטלית, שהיא שפה לא רציפה של פיקסלים. עלינו להמיר את התמונה מרמתה האנלוגית לרמה דיגיטאלית. קרני האור מהדמות הפוגעות במסך הרגיש לאור מכילות מגוון רציף של עוצמות אור וגווני צבע, אשר משוחזרות עד לרמת הפרדה הגבוהה ביותר של אור וצבע שמגבלות הדיפרקציה מאפשרות לה.
תמונות, כפי שאנו רואים אותן הן בדר”כ מרובעות או מלבניות ומכילות מספר רב של פיקסלים, מרובעים או מלבנים בהתאמה, כך שכל פיקסל המרכיב אותן מיוצג ע”י זוג קורדינטות עם ערכי המיוחדים רק לו ומסודרים במערך קואורדינטות קרטזי.
קוארדינטת X מציינת את המקום האופקי או מספר העמודה של הפיקסל וקורדינטת Y מציינת את המקום האנכי או מספר השורה של הפיקסל. התמונה הדיגיטלית מורכבת משורה של פיקסלים מלבניים או מרובעים שמיצגים שורות של ערכים ערוכים במערכת קואורדינטות של X ו- Y. במציאות קיים רק מערך סדרות של נתוני ערכים שהמחשב מארגן אותם כדי לייצר ייצוג דיגיטלי של הסצנה המקורית.
היחס בין המימד האופקי למימד האנכי של התמונה הדיגיטלית נקרא “יחס אספקטי” ומחושב ע”י חלוקת רוחב התמונה בגובה והוא מגדיר את הגאומטריה של התמונה.
שמירה על יחס אספקטי תיקני בשעת הצגת תמונות דיגיטליות, ימנע עיוות תמונה כאשר התמונה מוצגת בפלטפורמה מרוחקת. חשוב שלכל פיקסל יהיה יחס ממדים של 1:1 (פיקסלים מרובעים) על מנת להבטיח התאמה וצמצום העיוות בשעת עיבוד התמונה הדיגיטאלית באלגוריתמים סטנדרטים.
הפרדה מרחבית של תמונות דיגיטליות
התמונה כפי שהיא נראית על מסך המחשב לא בהכרח תגיע באיכותה לרמה הנצפית מבעד לעינית המקרוסקופ. מה שהוא קורה לפאזה האנלוגית כפי שהיא נצפית מבעד לעינית המקרוסקופ כשהיא עוברת לפאזה הדיגיטלית כפי שהיא נראית על מסך המחשב. חשוב שהמשתמש הדיגיטאלי במקרוסקופ יהיה מודע לאותו מה שהוא לפני שהוא רוכש מערכת הדמיה, כדי שיוכל לשמר אינפורמציה שהיא חשובה לו. איכות התמונה הדיגיטאלית נקבעת על פי צפיפות הפיקסלים ועל פי טווח הבהירות המאפין את הפיקסלים. ככל שצפיפות הפיקסלים במצלמה הדיגיטאלית יהיה גדול יותר, כך תגדל יכולתנו להעביר פרטים קטנים יותר מהתמונה האנלוגית כפי שנצפתה מבעד לעינית המקרוסקופ אל מסך המחשב.
לא בהכרח האינפורמציה שנקלטה ע”י האלמנט הרגיש לאור במצלמה תועבר במלואה מהפאזה האנאלוגית לפאזה הדיגיטאלית. יתכן מצב שהאלמנט הרגיש לאור במצלמה יהיה עתיר פיקסלים ואולם התמונה הדיגיטאלית כפי שנצפית על מסך המחשב לא תהיה עתירת פיקסלים כמוהו. המונח המאפין את כמות הפיקסלים שנעשה בהם שמוש בבנית התמונה הדיגיטאלית נקרא הפרדה מרחבית. ההפרדה המרחבית גבוהה יותר ככול שכמות הפיקסלים שנעשה בהם שמוש בבנית התמונה הדיגיטאלית גם הוא גדול יותר. איכות הדגימה והדיגיטיזציה של המידע האנלוגי והמרתו במידע דיגיטאלי משפיעה על איכות ההפרדה המרחבית. יש לדאוג לתאום בין כשר ההפרדה של מערכת ההדמיה וכשר ההפרדה של מערכת המחשוב. אין יתרון במערכת דגימה ודיגיטיזציה איכותית כאשר מערכת המחשוב נחותה ממנה.
איכות התמונה הנצפית מבעד לעינית המערכת האופטית (המקרוסקופ) קובעת את איכות מערכת ההדמיה הנדרשת. אם ברצוננו לשמר את איכות התמונה הנצפית, מערכת ההדמיה חיבת לספק את מספר הפיקסלים בצפיפות הנדרשת כדי ליצג את איכות התמונה האנלוגית, שאם לא כן פרטים חשובים עלולים ללכת לאבוד.
ציור מספר 2A מיצג רצף של עוצמות שתורמת כל נקודה על פני התמונה האנלוגית כפונקציה של המקום שלה בתוך התמונה. כאשר נמיר את האינפורמציה האנלוגית שבציור 2A לאינפורמציה דיגיטאלית בעזרת 32 דגימות דיגיטאליות נוכל עדין לשמר את מרבית מאפיני העוצמה והתדירות המרחבית של התמונה האנלוגית האורגינלית, כמודגם באיור 2B.
ככל שנרד בכמות הדגימות, נאבד בהמרה של אינפורמציה אנלוגית לדיגיטאלית יותר תדירויות מרחביות גבוהות ובמקומם נקבל תדירויות מרחביות נמוכות שלא היו קימות בתמונה האנלוגית האורגינלית, כפי שנתן לראות באיורים C ו- D.
משמעות הדבר, אם התמונה האנאלוגית האורגינלית כפי שנצפית מבעד לעינית תכיל מעברים מהירים של אור וצל, מעברים אלה ילכו לאבוד במערכת דגימה איטית ובמקומם יופיעו מעברי אור וצל איטיים, שכלל לא היו בתמונה המקורית. כאשר אנחנו רוצים לרכוש עבור המקרוסקופ שלנו מערכת הדמיה שתשמר את האיכויות של התמונה האנלוגית, עלינו לוודא שאיכות ההפרדה האופטית של מערכת ההדמיה תהיה עדיפה על הנדרש כדי לשמר את הצפיפות המרחבית של התמונה האנלוגית האורגינלית.
