מקורות לייזר למחקר במדעי החיים

ציטומטריה של זרימה היא טכנולוגיה חיונית ברפואה קלינית ובמחקר בסיסי בתחום מדעי החיים. מדי ציטומטריה של זרימה משתמשים בלייזרים, בזרמים ממוקדים באופן הידרו–דינמי של תאים בודדים ובגלאי פוטונים (בדרך כלל שפופרות הכפלת פוטונים), על מנת לנתח במהירות מגוון של מאפיינים פיסיים של כמויות גדולות של תאים.
הטכנולוגיה מאפשרת ביצוע מחקרים מפורטים בתחום האימונולוגיה, תוך אפיון תריסרי סוגים של תאים בודדים, אשר יוצרים מערכת חיסונית רגילה. מחקר כזה אפשרי דרך השימוש בנוגדנים חד שבטיים שפועלים נגד קולטני חלבון מסוימים על פני שטח תאי החיסון; כאשר הנוגדנים מחוברים לסמנים זוהרים, אפשר לגלות אותם על פני שטח התא באמצעות לייזר באורך גל נכון, ולאפשר אבחון מהיר של מגוון מצבים של חיסון עצמי (אוטואימוני) ומחלות.
קיימים אלפי סוגים של גששים זוהרים, שבאופן תיאורטי יכולים לשמש לציטומטריה של זרימה. את חלקם אפשר לחבר לנוגדנים ולחלבונים אחרים שיכולים לפעול על סמנים מסוימים שעל פני השטח של התא. אחרים, כולל חלבונים זוהרים שמתבטאים (כדוגמת GFP) יכולים לשמש לגילוי ביטוי של גנים בתאים. חיישנים זוהרים יכולים לשמש כדי למדוד את מצב הבריאות והתפקוד של התא, כולל שלמות קרום התא והפוטנציאל החשמלי שלו, התפקוד המיטוכונדרייאלי, ריכוז הסידן ותכולת ה–DNA; כל הגששים האלו חשובים למחקרים ביולוגיים בסיסיים של התא.
רק חלק קטן מבין סוגי הגששים הזוהרים הקיימים משמש באופן שוטף כיום לציטומטריה של זרימה, בעיקר בגלל המספר המוגבל של אורכי גל הלייזר שזמינים באופן מסורתי עם לייזרים מהסוג הישן מבוססי גז יוני ארגון במודדים מסחריים של ציטומרטריה של זרימה.
התפתחויות מהתקופה האחרונה בטכנולוגית לייזר של המצב המוצק שאוב דיודות (DPSS), הגדילו את מספר אורכי הגל שאותם אפשר לשלב באופן מעשי במדי ציטומטריה של זרימה. לייזרים מסוג DPSS ל–532 ננו–מטר ול–561 ננו–מטר הופכים ליחידות מקובלות יותר במכשירים אלו, כשהן מאפשרות לחוקרים ביו–רפואיים להשתמש במגוון חדש של גששים זוהרים, שדורשים עירור ירוק או צהוב. עם זאת היה קשה יותר למלא את הפער בין לייזרים של דיודות בתחום הצהוב ב–561 ננו–מטר לבין לייזרים של HeNe או לייזרים של דיודות בתחום האדום (630–640 ננו–מטר).
על אף שלייזרים HeNe בתחום הכתום הפולטים אורך גל של 594 ננו–מטר קיימים מזה זמן, ההספק שלהם נמוך ביותר, ולכן הם משולבים לעתים נדירות במדי ציטומטריה של זרימה. לייזרים HeNe לתחום הכתום שולבו במיקרוסקופים קונפוקליים, כשהם מאפשרים את השימוש בגששים זוהרים לעירור כתום במיקרוסקופיה. עם זאת, לא היה אפשר להעביר את היישומים האלו לציטומטריה. היכולת לבצע עירור בטווח 590 – 595 ננו–מטר היה יכול להיות שימושי ביותר מפני שקיימים כמה סוגים של גששים זוהרים – לרבות כמה חלבונים זוהרים מתבטאים שפותחו לאחרונה – אשר מקבלים עירור באופן מיטבי בטווח זה של אורכי גל. אור לייזר כתום היה הפער העיקרי האחרון ביכולות העירור בציטומטריה של זרימה.
לאחרונה, פיתחו כמה יצרני לייזר מודולים בתחום זה, עם מפרט שמתאים לניתוח פלאורוסצנציה. דוגמה לכך היא Cobolt Mambo ב-594 ננו מטר (עיין באיור 1), שאותו אפשר לקבל ברמות הספק של 25, 50 ו-100 מילי וואט, הרבה מעבר למינימום שנדרש כיום לצורך ציטומטריה של זרימה.
סוג זה של לייזר DPSS חד אופני (Single mode) מתאים במיוחד לשימוש ביישומי ניתוח פלואורוסצנציה דורשניים, כגון ציטומטריה של זרימה, מפני שהוא מספק יציבות הספק טובה במיוחד, רעש עוצמה נמוך מאוד (של פחות מ- 0.3 אחוזים rms), TEM מושלם כמעט וקרן עם התפצלות נמוכה (של M2 < 1.1) – שהם כל המאפיינים הדרושים לתוצאות טובות בציטומטריה.
הלייזר מבוסס על תכנון בעירוב תדירויות באמצעות טכנולוגיה קניינית של אשלגן טיטניל זרחני מקוטב לסירוגין (PPKTP) לקבלת גמישות ונצילות מיטביות. מעבר לכך, הלייזר מיוצר בהיותו נתון במארז אטום הרמטי וקומפקטי, תוך שימוש בטכנולוגיה הקניינית HTCure לקבלת עמידות טובה ביותר, והוא מאפשר שילוב במכשירים של מדעי החיים מהשורה הראשונה. כמה יצרנים אחרים, בהם חטיבת Spectra_Physics Lasers של חברת Newport וחברת MPB Communications מייצרות אף הם לייזרים בתחום הכתום.
דוגמה של ניתוח ציטומטריה של זרימה באמצעות מודול של 594 ננו–מטר מוצגת באיור 2. מודול Cobolt Mambo ל-50 מילי וואט שולב במד הציטומטריה של זרימה LSR II של
BD Biosciences ושורת תאי לימפומה של עכבר (EL4) סומנה בקולטן החוץ תאי CD44 באמצעות נוגדנים המחוברים עם אחד מבין כמה גששים זוהרים. Texas Red היא פרודה זוהרת בעלת משקל מוליקולרי קטן ומראה עוצמת תאורה חזקה עם רקע בעל פלואורסצנציה עצמית קטנה. אפשר לחבר אותה בקלות לנוגדנים והיא נחשבת לצבען זוהר מצוין שמתאים ליישומים של גילוי באמצעות נוגדנים.
כפי שמתואר באיור 2a, אפשר לבצע עירור של Texas Red באופן מיטבי בעזרת הלייזר של 594 ננו–מטר. הפרודה משמשת במיקרוסקופיה פלואורסצנטית (בעזרת קו 577 ננו–מטר של נורת קשת כספית), אבל לא נמצאת בשימוש נפוץ בציטומטריה של זרימה, מאחר שאורך גל זה לא היה זמין במכשור הציטומטריה.
מודול 594 ננו–מטר מעורר היטב את הגשש הזה (עיין באיור 2b). לתחליף של Texas Red, שהוא Alexa Fluor 594 של חברת Invitrogen, יש תכונות עירור ופליטה זהות כמעט לאלו של Texas Red, אבל היא בעלת עוצמה גבוהה יותר, והיא יציבה יותר מבחינת האור. אפשר גם לעורר אותה ב-594 ננו–מטר. את אלופיקוציאנין (APC) ואת הצבען הצמוד העוקב לו APC-Cy7 היה נהוג לעורר, בדרך כלל, עם מקורות לייזר HeNe ודיודה בתחום האדום, כפי שנראה בספקטרומים של העירור שלהם (איור 2a). עם זאת, אפשר גם לעורר אותם באמצעות מקור של 594 ננו–מטר ולשלב אותם עם Texas Red לצורך ניתוח בריבוי צבעים, באמצעות קו הלייזר הכתום (איור 2b).
Texas Red, APC ו- APC-Cy7 מתאימים לחיבור אל נוגדנים ולסימון באמצעות נוגדנים של קולטני יעד. חלבונים זוהרים, שהם סוג אחר של גששים זוהרים, מוחדרים בפועל כגנים שאפשר לקודד אותם אל תוך התא, שבו אנו מעונינים. כאשר מנגנון שעתוק ותרגום הגנים של התא מבטא את החלבון, החלבון זוהר כאשר הוא עובר עירור בעזרת לייזר באורך גל נכון. גששים אלו הם סמנים מצוינים לביטוי גנים וניתן להשתמש בהם במגוון של משימות אחרות, שבהן נדרש ביטוי גנים עצמיים תוך תאי של הגשש הזוהר.
אתGFP , שהוא הידוע בתור הטוב ביותר מבין הסמנים האלו, אפשר לעורר היטב באורך הגל המוכר 488 ננו–מטר. עם זאת, התפתחויות אחרונות בתחום הניבו מגוון רחב של חלבונים זוהרים עם נקודות שיא לעירור בתחום שבין ירוק לאדום. החלבונים הזוהרים באדום עם אורכי הגל הארוכים ביותר לעירור, כוללים את mPlum, TagFP635 (הידוע בשם המדעי mKate) ו-TurboFP635 (הידוע בשמו המדעי Katushka) (עיין באיור 3a). לחלבונים אלו נדרש עירור באורכי גל ארוכים יותר באופן משמעותי מאשר 488 ננו-מטר, אם כי פחות מהטווח של לייזר HeNe או לייזר דיודה בתחום האדום. לייזרים בתחום האדום מספקים עירור גרוע לחלבונים אלו. אורך הגל 594 ננו–מטר הוא הטוב ביותר ומספק עירור מצוין לכל שלושת הגששים (איור 3b).
קיים מגוון של גששים זוהרים בעלי עירור בכתום שיכולים היו להיות שימושיים בציטומטריה של זרימה, אם היו קיימים לייזרים באורך גל מתאים. אחד השימושים האלו הוא הסימון היציב של תאים בגשש זוהר שמאפשר גילוי בלייזר, לאחר הזרקה לחיית מעבדה. CellTracker Red של Invitrogen הוא אחד מהצבענים קושרי החלבון האלו שנדרש לו עירור בכתום. למעשה, מאחר ש- HeNe האדום ולייזר דיודה האדום לא מספקים עירור טוב לגשש זה, המקור של 594 ננו–מטר הוא הלייזר היחיד שבו אפשר להשתמש.
כדי שחוקרים ויצרני מכשור יוכלו לנצל את אפשרויות העירור החדשות האלו בכתום, חשוב ביותר גם שיהיו מסננים מתאימים. המסננים האופטיים חייבים להיות מתוכננים עבור שילובים מסוימים של אורכי גל של לייזר, ועליהם למלא תפקיד חשוב בשיפור עד למקסימום, של התפוקה, הרגישות והניגוד במכשור פלואורוסצנציה.
אפשר להשיג את התלילות החדה הנדרשת בשילוב עם יכולת ההעברה הגבוהה בפס ההעברה של המסנן והחסימה הגדולה של אורכי גל לא רצויים, באמצעות מסנני התאבכות בציפוי קשה של שכבות דקות. איור 5 מציג מסננים אופטיים בציפוי קשיח שמתוכננים במיוחד על ידי חברת Semrock עבור לייזר של 594 ננו–מטר.
למבחנים בריבוי צבעים, עם פרמטרים מרובים בעלי מורכבות שגדלה ומתפתחת, בציטומטריה של זרימה, יש צורך בקווי לייזר מרובים בו בזמן ובהפרדה של אותות פליטה בצבעים שונים ובמרווחים קטנים.
כיום קיימים מסננים שמתוכננים במיוחד לצורך ריבוב של 6 קווי לייזר ואף יותר, כולל קו 594 ננו–מטר של Semrock. לדוגמה מסנני LaserMUX של החברה מאפשרים שילוב קרני לייזר מרובות עם הפסדים נמוכים באופן יוצא דופן, וניצול הוספה של יכולת עירור בכתום לתוך ציטומטריה של זרימה, ולמכשירים אחרים המשמשים לניתוח פלואורוסצנציה.
ביחד, הנתונים האלו מראים מספר דוגמאות שבהם עירור בלייזר של 594 ננו–מטר יכול להרחיב את היכולת שלנו לנתח תאים בעזרת ציטומטריה של זרימה. הלייזר באורך גל זה ממלא פער משמעותי של עירור בין קו 561 ננו–מטר הנפוץ בשימוש היום לבין מקורות הלייזר האדומים. הוספה של אורך גל זה לאוסף מקורות העירור מאפשרת עירור של כל גשש זוהר כמעט שנראה לעין עבור ניתוח ציטומטריה.
*הכתבה נמסרה באדיבות להט טכנולוגיות