אחד ועוד אחד שווה שלוש לייזרי סיבים מרובי-קווים עבור מיקרוסקופיה לא-ליניארית

כל טכניקה ביו-רפואית חייבת להוכיח את אפשרות היישום שלה במחקר ובאבחון היום-יומי, ולא רק ב”ניסויי-גבורה”. וההצלחה של שיטת הדמיה חדשה תלויה משמעותית בעלות ומורכבות המכשיר בשימוש כאשר הלייזר משחק תפקיד חשוב בשני ההיבטים. דבר זה נכון במיוחד כאשר דרושים פולסי לייזר קצרים ביותר, כאשר זהו המקרה עבור כל טכניקות ההדמיה הלא-ליניאריות.

במאמר זה, נדון ביתרונות של לייזר סיבים עבור מכשירים משולבים ונציג מושג של לייזר-סיבים חדש יעיל-לעלות וללא תחזוקה אשר מספק פולסים של פמטו-שניות בשלושה אורכי-גל קבועים. דבר זה מאפשר עירור של כל הסמנים הפלואורסנטיים המקובלים ומאפשר הדמיה בו-זמנית מרובת-צבעים של 2 פוטונים עם זמני רכישה קצרים.

מיקרוסקופיה אופטית לא-ליניארית
בשאלות ביולוגיה רבות, החוקרים מבקשים לראות את נושא ההתעניינות שלהם ברזולוציה תלת-ממדית (3D) ברמה התאית (cellular). במיקרוסקופ בעל מוקד משותף, רזולוציית 3D זאת מושגת על-ידי חריר, הדוחה את הפלואורסנטיות מחוץ-למוקד ומשיג רזולוציה של כ-200 עד 250 ננו-מטר רוחבית ו-500 ננו-מטר צירית. לטכניקות של מיקרוסקופיה לא-ליניארית דוגמת הדמיית עירור של 2 פוטונים (שהוכחה לראשונה ב-1990 [1], יצירת הרמוניה שנייה (Second Harmonic Generation – SHG), יצירת הרמוניה שלישית (Third Harmonic Generation – THG) או Coherent Antistokes Raman Scattering מאידך, יש יתרון גדול, שהן מספקות עצמותית (intrinsically) רזולוציית 3D וכל התאורה הפלואורסנטית המיוצרת יכולה לשמש ליצירת התמונה. לדוגמה, מיקרוסקופיים עירור 2 פוטונים (2-photon) משתמשת בעובדה שפלואורופור יכול לספוג ביחד שני פוטונים של כ-כפליים אורך-הגל העירור של פוטון אחד (כלומר מחצית האנרגיה הדרושה כדי לעורר את הפלואורופור). תהליך זה תלוי בריבוע עצמת התאורה ולכן יופיע רק במוקד האובייקטיב עצמו, תוך יצירת “חלוקות אופטיות” (optical sections) של הדגימה הדמויה (עם רזולוציה דומה למיקרוסקופיה בעלת מוקד משותף). דבר דומה תקף עבור ה-SHG, בהבדל שזהו תהליך קוהרנטי ודורש מבנים לא centrosymmetric. מבנים כאלה מסוגלים להמיר את האור הפוגע למחצית אורך הגל הראשוני (לדוגמה מ-900 ננו-מטר ל-450 ננו-מטר). בדגימות ביולוגיות, בעיקר קולאגן, microtubules או myosin יוצרים אותות SHG מספיק חזקים עבור ההדמיה. איור 1 מראה את רמות האנרגיה של טכניקות ההדמיה הלא-ליניארית המוזכרות לעיל.
הסמנים הפלואורסנטיים המשמשים לרוב מציגים שיא של עירור פוטון-יחיד בין 400 ו-500 ננו-מטר, ולכן דורשים אורך-גל של 2PE הנמצא באזור הקרוב לאינפרא-אדום. יתרונות כלליים של אורכי-גל לעירור ארוכים יותר אלה הם הנזק הפוטוני (photodamage) המוקטן של הדגימה ועומק החדירה הגבוה יותר (של מעל 1 ממ’) בשל הפיזור המועט יותר באורכי-גל ארוכים יותר (כמות האור המפוזרת יחסית הפוכה לחזקה הרביעית של אורך-הגל). יתר על כן, רקמה ביולוגית מציגה דבר המכונה “חלון אופטי” בין 600 ל-1300 ננו-מטר, היכן שהחדירה היא מרבית. בחלון זה, מים והמוגלובין, סופגי האור החשובים ביותר ברקמות, כוללים רק מקדם ספיגה חלש והפעולה-ההדדית בין האור והרקמה נשלטת על-ידי פיזור.
יתרונות אלה עושים את טכניקות ההדמיה הלא-ליניארית למועמדות בעלות פוטנציאל גבוה עבור מחקר ואבחון (קדם) קליני, במיוחד עבור הדמיה in-vivo לזמן ארוך.

פולסי לייזר של פמטו-שניות
ההדמייה של דגימות ביולוגיות בעזרת מיקרוסקופיה לא-ליניארית דורשת פולסי לייזר קצרים ביותר. הסיבה היא שלכל התהליכים האלה יש הסתברויות נמוכות מאוד ולכן הם זקוקים לצפיפויות פוטונים מאוד גבוהות כדי ליצור יחס אות לרעש מספיק גבוה. כדי לשמור על הספק ממוצע ברמה שתאים ודגמים יכולים לעמוד בה, יש להשתמש בפולסי לייזר קצרים עם משכי פולס באזור ה-100fs. הלייזר הוא כבוי רוב הזמן ופולט פוטונים רק במשך שבר שנייה (10-13s), אולם בהספקי שיא מאוד גבוהים של עשרות אחדות של קילו-ואט. פולסי פמטו-שנייה אלה מופקים לרוב על-ידי לייזרי Ti:sapphire שהם מערכות די יקרות, מגושמות ומאתגרות טכנית, והדורשות קירור אקטיבי. חלופות ללא-תחזוקה ממש, קומפקטיות וחסונות הן לייזרי סיבים מהירים-ביותר המספקים אחד או יותר אורכי-גל והם הפיתרון האידיאלי עבור שימוש של 24/7 במעבדות מחקר ושילוב מערכת.

לייזרי סיבים
לייזרי סיבים משתמשים בסיב אופטי באילוח (doping) של מרכיבי אדמות-נדירות (כגון ארביום, איטרביום, דיספרוסיום, פראסיאודיניום, תוליום) בתור תווך בעל שבח פעיל. הם יכולים להיות מאוד קומפקטיים, מאחר שאת הסיב ניתן לכופף ולעגל כדי לחסוך מקום. באור טבעי הם מאופיינים באיכות אופטית גבוהה והם מאוד חסונים, אמינים ולא-רגישים לתנאי סביבה משתנים. הם מציעים פעולה מושלמת להפעלה בעלת אפס-תחזוקה ביסודה מאחר שהם פועלים ללא אופטיקה בעלת אלומה חופשית והם גם מאוד יעילים לעלות. בהשוואה ללייזרי Ti:sapphire, ללייזרי סיבים יש הרבה פחות צריכת הספק והם דורשים רק קירור אוויר פאסיבי. עם תכונות אלה, לייזר סיב הוא הכלי האידיאלי עבור מחקר וגם יישומים (קדם) קליניים פוטנציאליים.

אורכי-גל עבור מיקרוסקופיה של 2 פוטונים
עירור פלואורסנציה של 2 פוטונים דורש אורכי-גל לעירור החל מ-750 ננו-מטר עד כ-1050 ננו-מטר. אורך הגל הבסיסי של לייזר סיב באילוח ארביום ניתן להמיר בתדר בקלות וביעילות ל-780 ננו-מטר. אורך-גל זה מתאים ל-2-PE של צבעים סינתטיים בשימוש רב [2]. הסיבה היא בתכונות הספקטרוסקופיות של הפלוארופורים. הרבה פלואורופורים שאינם מציגים ספקטרומי עירור של 1 פוטון חופפים ניתנים לעירור יעיל באותו אורך-גל של 2-PE. מרבית הספקטרומים 2-PE הם די רחבים, כך שהרבה צבעים הדורשים אורכי-גל לעירור שונים במקרה של ה-1 פוטון ניתנים לעירור תואם ל-2 פוטונים בעזרת רק אורך-גל אחד (קבוע). בנוסף, המירב 2-PE מוזז לעתים קרובות לקראת אורכי-גל קצרים יותר בהשוואה לכפליים אורך הגל של עירור ה-1 פוטון. המירב 2-PE של Alexa 568 לדוגמה ניתן לצפות מסביב ל-1140 ננו-מטר (כפליים מירב העירור של 570 ננו-מטר של 1 פוטון). למעשה, הוא מתגלה כ-780 ננו-מטר. מסתבר שלצבעים סינתטיים בשימוש רחב יש מירב של 2-PE ב-780 ננו-מטר או בסביבה זו, בדיוק כמו צבעים מסוימים ממשפחת Alexa המבוססת Alexa 488, Alexa 568 ו-Alexa 594 .
הפרוטאין הפלואורסנטי הירוק (green fluorescent protein – GFP) ונגזריו משחקים תפקיד מרכזי במיקרוסקופיה (מולטי-פוטונית). חיישנים מקודדים גנטית אלה גרמו למהפכה בהדמיית גופים חיים (פרס נובל בכימיה 2008, Shimomura, Chalfie, Tsien). הם יכולים במיוחד לסמן תבניות מבלי להכין את הדגימה בנהלים רעילים ומכתימים וצבעים סינתטיים. חוקרים יכולים להשתמש בפרוטאינים פלואורסנטיים כדי לדמות את ההובלה, האיתור והפעולה ההדדית של פרודות שונות בגוף החי. GFP שהוא הפרוטאין הפלואורסנטי המבודד הראשון נמצא כעת בשימוש רחב במחקר, תודות לקווי התאים היציבים והפרוטוקולים שנקבעו. ל-GFP יש נקודת מירב מסביב ל-920 ננו-שניות, כך שגם אורך-גל זה משחק תפקיד מרכזי במיקרוסקופיה של התא-החי.
גרסאות חדשות דוגמת ה-GFP בעלי אורכי-גל שונים לעירור פליטה מאפשרים הדמיה מרובת-צבעים. לאחרונה הופיע דור חדש של פרוטאינים אדומים-פלואורסנטיים, בעלי ספקטרומי עירור ופליטה ארוכי-גל, המציעים ספיגה ופיזור נמוכים יותר ולכן עומקי חדירה גבוהים יותר. באורכי-גל העירור הללו, האות הפלואורסנטי הוא גם פחות מושפע פלואורסנציה-עצמית בלתי-רצויה. פרוטאינים פלואורסנטיים אלה אשר פותחו לאחרונה מציגים נקודות מירב בין 1000 ננו-מטר ו-1100 ננו-מטר [4]. משטר אורכי-גל זה מושך ביותר עבור מיקרוסקופיית SHG של קולגן או micro-tubules בגופים חיים גם, תוך יצירה של אות SHG בתחום הנראה והצעה של עומקי הדמיה של מספר מאות מיקרונים.
בסיכום, שלושה אורכי-גל של עירור המכסים את המשטרים השונים עשויים להיות מספיקים כדי לטפל בכל יישומי ה-2-PE: אורך-גל אחד מתחת או בסביבת 800 ננו-מטר, אורך גל שני מסביב ל-900 ננו-מטר (במיוחד עבור GFP) ואורך-גל שלישי מעל 1000 ננו-מטר עבור סמנים פלואורסנטיים באדום-רחוק.
רעיון חדש של לייזר עבור מיקרוסקופיה לא-ליניארית
גישה חדשה לחלוטין עבור מיקרוסקופיה לא-ליניארית היא ה-dichro Femto-Fiber. מערכת סיב זו מספקת שני אורכי-גל מפתח (aperture) אחד: 780 ננו-מטר ו-1030 ננו-מטר. ה-780 ננו-מטר מופק על-ידי הכפלת התדר היסודי של המתנד Er-fiber. הזזת תדר מפיקה 1030 ננו-מטר, מוצא אורך הגל השני. איור 2 מראה את סכמת הלייזר. מאחר שמתנד אחד מפיק את שני המוצאים, הם מסונכרנים בזמן במלואם. בעזרת קו השהיה באחת משתי הזרועות, המשתמש יכול להזיז את הפולסים של אחד מאורכי-הגל ביחס למוצא השני. דבר זה מאפשר כיוון של החפיפה בזמנים של הפולסים, כך שניתן לכוון ששני הפולסים יגיעו ביחד או בהשהיית זמן אל הדגימה. הלייזר משדר את שני אורכי-הגל בצורת קו-ליניארית, כך ששני המוקדים יחפפו במלואם ב-x ו-y בדגימה. אולם בשל העיוותים (aberrations) הכרומטיים במיקרוסקופ ניתן להזיז את שני המוקדים בכיוון ה-z (רוב אופטיקות המיקרוסקופים המקובלות מתקנות את העיוותים הכרומטיים בתחום הנראה בלבד ולא באינפרא-אדום). ניתן לתקן בנקל עיוותים אלה על-ידי כיוון ההתבדרות (divergence) עבור אחד משני אורכי-הגל. אחרי כיוון חד-פעמי זה של כל מיקרוסקופ, לשני המוקדים תהיה חפיפה מרחבית מושלמת.
בשל תכונות אלה לייזר הסיב הוא מקור אור מבטיח עבור מיקרוסקופיה של שני פוטונים. ניתן להשתמש בשני אורכי-הגל בנפרד עבור 2-PE מקובל של פלואופורים מתאימים. בנוסף, עיצוב לייזרי מיוחד זה מאפשר עירור של פלואורופורים עם מירב של 2-PE בין שני אורכי-הגל במוצא. כאשר הפולסים של שני אורכי-הגל חופפים במרחב ובזמן, עשוי לקרות תהליך המכונה 2-color 2-PE (איור 3). תהליך זה כבר הוכח בהיערכות טכנית שונה, ראה לדוגמה [5]. הפלואורופור קולט ביחד פוטון של 780 ננו-מטר ופוטון של 1030 ננו-מטר. דבר זה מתאים לאורך-גל של עירור וירטואלי של , אורך-גל המאפשר לדוגמה לעורר GFP.

תוצאות: נוירונים וניוטרופילים
איור 4 מראה תוצאות ראשונות של לייזר הסיב החדש על מיקרוסקופ Intravital2P (FEI) ,Munich. הדגימה היא חתך של שטח ה-Hippocampus של מוח של עכבר (באדיבות Prof. Herms, LMU, Munich). כ-10% מהנוירונים מבטאים את הפרוטאין yellow fluorescent . תאי הדם הלבנים ניוטרופיל מסומנים ב-GFP (b), green circle. איורים 4(c)-(f) מראים את אותות הפלואורסנטיות עבור אורכי-גל עירור שונים: 780 ננו-מטר, 1030 ננו-מטר (d), שני אורכי-הגל עם (e) ובלי (f) חפיפת זמן בדגימה. 1030 ננו-מטר מעורר את הפלואורסנטיות YFP גם ביעילות מאחר שספקטרום העירור של 2 פוטון YFP מראה כתף (shoulder) מסביב ל-1030 ננו-מטר. אם שני הפולסים מגיעים למוקד בו-זמנית (e), הם יכולים גם לעורר את תאי הדם הלבנים הנייטרופילים המבטאים GFP. תוצאה זו עם הלייזר סיב החדש דומה לעירור הדגימה עם לייזר Ti:sapphire המכוון ל-900 ננו-מטר (g).

סיכום
לייזרי סיבים הם חלופות קומפקטיות, אמינות וקלות לשימוש ללייזרי Ti:sapphire מורכבים עם מערכות בעלות אורך-גל קבוע מבוססות ב-780 ננו-מטר ו/או 1560 ננו-מטר שהן עדיין משמשות לעתים קרובות עבור יישומים בעלי מטרה-יחידה (לדוגמה הדמיית סידן עם פלואו-4). מערכת לייזר סיבים חדשה מספקת עתה שלושה אורכי-גל בו-זמנית. שלושת אורכי-גל אלה מאפשרים עירור של כל הסמנים הפלואורסנטיים המקובלים המשמשים עבור מיקרוסקופיית -2פוטונים: מגוון צבעים סינתטיים שניתן לעורר ב-780 ננו-מטר והרבה פרוטאינים פלואורסנטיים אדומים ב-1030 ננו-מטר. אורך-הגל המדומה 888 ננו-מטר מאפשר עירור סמנים עם מירב של 2-PE מסביב ל-900 ננו-מטר, דבר המשמעותי במיוחד עבור דגימות מבוטאות-GFP. מאחר שכל שלושת אורכי-הגל זמינים בו-זמנית זוהי המערכת המסחרית הראשונה המאפשרת להריץ ניסויי 2-PE רב-צבעים בתאים חיים עם זמני רכישה קצרים (שניתן להשוותם להדמיית צבע אחד 2PE). המערכת הרובוסטית שכולה סיב היא פיתרון נוח עבור מכשירים משולבים ולכן הם יתמכו בהצלחה הנוספת של טכניקות הדמיה לא-ליניאריות במעבדת מחקר ומעבר לכך.
סימוכין:
[1] W. Denk, J. H. Stricklerand and W. W. Webb, Two-photon laser scanning fluorescence microscopy, Science 248, 73–76 (1990)
[2] T. Franke, M. S. Kolosov, M. A. M. J. van Zandvoort andM. Langhorst, Trouble-Free 2-Photon Microscopy, GIT Imaging Microscopy 16, 30–32 (2014)
[3] http://www.drbio.cornell.edu/cross_sections.html.
[4] M. Drobizhev, N. S. Makarov, S. E. Tillo, T.E. Hughes and A. Rebane, Two-photon absorption properties of fluorescent proteins, Nat. Methods 8, 393–399 (2011)
[5] P. Mahou et al., Multicolor two-photon tissue imaging by wavelength mixing, Nat. Methods 9, 815–818 (2012)

Marion Lang קיבלה את תואר ה-PhD שלה בפיזיקה מאוניברסיטת Heidelberg ב-2007. היא הצטרפה ל-Toptica ב-2010. כמנהלת השיווק היא כעת אחראית על השיווק העולמי של לייזרי דיודות וסיבים של Toptica.
הכתבה נמסרה באדיבות חברת להט טכנולוגיות