דיגום ספקטראלי במיקרוסקופיה פלואורסצנטית – חלק א

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית היא טכניקה אוניברסלית המתפתחת כל העת המאפשרת מבט בתוך העולם הביולוגי בקנה-המידה של אורך מיקרוני ופחות מזה, והמאפשרת גישה ישירה לתוך המקום המרחבי וההתנהגותי של פרודות קטנות ברמת התאים. רמת ביצועים זו ניתנת להשגה רק בעזרת תכנון מדויק של המכשור ושימוש ברכיבים אופטיים איכותיים ובעלי ביצועים גבוהים, דוגמת המסננים האופטיים. מסננים אופטיים משדרים וחוסמים אור (באמצעות החזרה) בתחומים ספקטראליים מיוחדים מוגדרים היטב. מסננים בעלי העברה גרועה, תלילות קצוות וחסימה מציעים ביצועים מוגבלים, ובמקרה של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, יכולים לגרום לרכישת תמונות בעלות ניגודיות חלשה המגבילה את היכולת לחשוף את סודות העולם התת-תאי (subcellular). כדי למנוע מגבלה זו, המיקרוסקופיסטים עברו במהירות למסנני התאבכות  (interference) חדשניים בעלי שכבה דקה (thin-film) וציפוי קשיח (hard-coated). בשל התפקיד הקריטי שהמסננים האופטיים משחקים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, חשוב להבין כיצד מסננים אלה מעבירים הן את אות הפלואורסצנטיות הרצוי והן את אור הרקע הבלתי-רצוי (דהיינו ה”רעש האופטי”).
שני שיקולי ביצועים קריטיים עבור כל מערכת אופטית המייצרת, לוכדת ורושמת אור פלואורסצנטי הם רמת אות האור הרצוי ורמת האור הבלתי-רצוי או הרעש האופטי הנוצר, לדוגמה, מאור תועה ומפלואורסצנטיות הרקע. ידיעת הרמה של כל אחת מעוצמות האור הללו מאפשרת לחשב את היחס אות-לרעש של המערכת (SNR), המאפשרת כימות הביצועים המיקרוסקופיים. הגדרה פשוטה של ה-SNR היא

כאשר S היא האות הכולל המשודר (הרצוי) בפלואורסנציה ו-N הרעש (הבלתי-רצוי) הכולל, המכיל את תרומות רעש אור העירור (NE) ורעש הפלואורסנציה (NF). הערך המספרי המופק על-ידי החישוב הנ”ל משמש לקבלת מידה סבירה של ביצועי המערכת הכוללים, הקשורים לרוב היטב עם תפיסת הצופה על נאמנות התמונה הפלואורסצנטית.
הרעש האופטי מתבטא כהפחתת הניגודיות של התמונה בין אזורים בעלי עניין (regions of interest – ROI)  בהם ממוקם פלואופור (fluophore) המטרה, הפולט פוטונים של פלואורסנציה בעקבות ערור מתאים, והאזור הסובב בו לא קיים פלואופור-מטרה. במקרה של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, תמונות עם SNR גדול מ-20 נחשבות קבילות, עם ערכי SNR גדולים מ-40 רצויים [1]. במקרים בהם ה-SNR קטן מ-20 לערך, דרוש שיקול זהיר כדי לקבוע ולהבין את מקור ניגודיות התמונה המופחתת. איור 1 מציג תמונה פלואורסצנטית של FITC הקשורה לנוגדני סמן מטרה CD41 (עכבר). מאיור זה ברורה ההשפעה של אותות אור בלתי-רצויים (כלומר רעש אופטי) על ניגודיות התמונה. מדוגמה פשוטה זו, ברור שבחירת המסננים הנכונים התואמים ומעבירים את המאפיינים הספקטראליים של פלואורסצנטיות-המטרה ובאותו הזמן חוסמים אור בלתי רצוי היא קריטית לצורכי רישום תמונות המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית עם ניגודיות גבוהה ובהירות גבוהה.

דיגום מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
מיקרוסקופי פלואורסנציה מסודרים לרוב בתצורה אפי-פלואורסצנטית, כמוצג באיור 2 (משמאל). אור העירור, הן ממנורת קשת עוצמתית והן מלייזר, עובר דרך מסנן “ערור” מעביר-פס, מוחזר על-ידי”dichoic beamsplitter”  ומאיר את משטח הדגימה בעזרת עדשת האובייקטיב של מיקרוסקופ. בתצורה האפי-פלואורסצנטית לאובייקטיב של המיקרוסקופ שני תפקידים חשובים, הפועל הן כמעבה לכיוון אות העירור על הדגימה והן האובייקטיב לאיסוף הפלואורסנטיות הנפלטת. לאחר מעבר דרך האובייקטיב ומחלק האלומה,  הפלואורסנציה הנפלטת מועברת דרך מסנן “משדר” מעביר-פס שני ומועברת לאחר מכן לתוך העין של צופה או אל מצלמה. כמו כן מוצגים באיור 2 (מימין)  פרופילים ספקטראליים המייצגים מאפיינים ספקטראליים של הרכיבים האופטיים המבקרים את ההעברה והחסימה של האור, כמו גם ספקטרומי הבליעה והפליטה של פלואורופור-מטרה.

בליעת האור ופליטת הפלואורסצנטיות
פליטה פלואורסצנטית הנובעת מבליעת אור ממקור עירור תלויה במאפייני הבליעה והפליטה של פלואופור-המטרה, ריכוזו בדגימה ואורך הנתיב האופטי, או אורך הבליעה האופייני, l, של הדגימה. בליעת האור על-ידי פלואורופור (או יותר כללי מערכת פרודות, כגון ריכוז הפלואורופורים בתוך תא) מובנת בנקל על בסיס חוק Beer-Lambert, הקובע

כאשר Il(l) היא עצמת האור התלויה באורך הגל הנפלטת מלוח בעובי l, וה-I0(l)
היא עצמת האור הפוגע. מקדם הכיבוי e(l)
(בעל מימדים של Mole-1 cm-1) וריכוז פלואורופור המטרה c (במולים) קשורים לחתך הפעולה הפרודתי s(l) (בעל ממדי סמ2) וצפיפות הפלואורופור n (מספר הפרודות ליחידת נפח) דרך הקשר

נוכל עתה לעיין בכמות הכוללת של אור נבלע על-ידי תווך כלשהו המכיל ריכוז של פלואורופורים. באופן מתמטי, עצמת האור הנבלע ניתנת לביטוי על-ידי

כאשר I0(l) ו-I1(l) הם כפי שהוגדרו לעיל. לאחר הצבת I1(l) ובהסתמך על המקרה של ריכוז פלואורופור נמוך, עצמת האור הנבלע Iabs(l) ניתנת לחשב בקירוב כ-

תכונות בליעת הפלואורופור מאופיינות לרוב על-ידי פרמטר המכונה “decadic molar extinction coefficient” או e10, הקשור ל- e(l)  לפי

ניתן לייחס את מקדם הכיבוי לפרופיל הספקטראלי של בליעת הפלואורופור המנורמלת FA(l) דרך הקשר הבא

כאשר e10peak מייצג את הערך המרבי של מקדם ה-decadic molar extinction coefficient והוא מספר שניתן לקבל בקלות מיצרן הפלואורופור או על-ידי מדידה. שילוב של הקשרים הנ”ל, עצמת הבליעה בריכוז c של פלואורופור ניתנת לביטוי על-ידי

להלן אנחנו נבחן סידור אפי-פלואורסנציה טיפוסי ונקבע I0(l). במיקרוסקופיה פלואורסצנטית אור העירור עובר תחילה דרך מערך של רכיבים אופטיים המכוון ומכין את האור כדי לספק הארה מרבית ואחידה של השדה במישור הדגימה, מועבר לאחר מכן על-ידי מסנן המעורר לקבלת חסימה מחוץ-לתחום, מוחזר לאחר מכן על-ידי ה-dichoic beamsplitter, וממוקד בסוף על-ידי אובייקטיב המיקרוסקופ אל הדגימה. מבחינת התופעה, ניתן לבטא על-פי שיקול  זה את העצמה הפוגעת כ-

כאשר IL  היא עצמת השיא ו-L(l) הוא הפרופיל הספקטראלי המנורמל של מקור האור המעורר, Tx(l) הוא ספקטרום ההעברה של מסנן העירור, RD(l) הוא ספקטרום ההחזרה של ה-dichoic beamsplitter, ו-Ti הוא גורם המוכנס כדי להתחשב בהעברה הכוללת של כל יתר האופטיקות בנתיב אור העירור. כאן אנחנו מניחים ש-Ti הוא גורם אמפירי הניתן לשינוי. אולם, במצבים מעשיים גורם זה הוא פונקציה של אורך-הגל וניתן לכלול אותו באינטגרציה המלאה, אם לדוגמה פרופיל ההעברה של אובייקטיב המיקרוסקופ ואופטיקות אחרות ידועים. העצמה הנבלעת בדגימה ניתנת לביטוי על-ידי

שים לב שכל הכמויות התלויות באורך-הגל משולבות יחד בצד הימני של הביטוי הנ”ל. כדי לקבוע את עצמת האור הנבלע הכללית A (ללא תלות באורך-הגל), מבצעים אינטגרציה פשוטה על כל אורכי-הגל:

לאחר עירור, פרודת פלואורופור פולטת פלואורסנציה בכל הכיוונים. בעקבות הנוסחה הנ”ל המתארת את נתיב העירור, עצמת אור הפלואורסנציה הנפלט המגיעה לגלאי ניתנת לביטוי על-ידי

כאשר W הוא זווית האיסוף המוצקת וניתנת לקביעה על-ידי ידיעת הפתיחה המספרית של אובייקטיב המיקרוסקופ בשימוש hF היא התשואה הקוונטית עבור פלואורסנציה, A היא עצמת האור הנבלע (כפי שחושבה לעיל), fE(l) הוא פרופיל הפליטה הספקטראלית של הפלואורופור, TD(l) ו-TM(l) הם ספקטרומי ההעברה של המסננים הדיכואיק והפליטה, בהתאמה, ו-D(l) הוא פרופיל ההיענות של הגלאי. בדומה ל-Ti, הגורם To הוא גורם אמפירי המייצג את ההעברה המשולבת של האופטיקות האחרות בנתיב הפליטה., ניתן לחשב לאחר מכן את האות הנפלט הכולל, S, על-ידי אינטגרציה של אות האור הנפלט    Iem(l) על-פני כל אורכי-הגל:

לאחר שנקבעה מסגרת מתמטית לחישוב אות הפלואורסנציה הנפלט S, הנבנה מסביב להבנה של מיקרוסקופ פלואורסנציה פשוט, אפשר עתה להשתמש בגישה הנ”ל כדי לקבוע את רעש העירור (NE) ורעש הפלואורסנציה (NF).

מקורות של רעש אופטי
קיימים שני מקורות עיקריים של “רעש” אופטי במיקרוסקופ פלואורסנציה, דהיינו: (i) רעש אור העירור, בצורת אור תועה לא חסום; ו-(ii) פלואורסנציית רקע שאינה נובעת מהפלואורופורים הרצויים הקשורים למטרות רצויות. פלואורסנציית רקע ניתנת לחלוקה בהמשך לשני סוגים עיקריים: אוטו-פלואורסנציה מהדגימה ו/או תווך סובב כמו גם מרכיבים אחרים במערכת, כגון אובייקטיב המיקרוסקופ בעצמו (המכונה בהמשך אוטו-פלואורסנציה), ופלואורסנציה מהפלואורופורים הרצויים שאינם קשורים למטרות המכוונות הספציפיות בעלות עניין (המכונות: “קישור לא-ספציפי”). פלואורסנציית רקע היא מקור הרעש הבעייתי ביותר לניהול בהרבה מצבים, בעוד רעש אור העירור ניתן ל”בטל” ממערכת אופטית הממוטבת בצורה קפדנית
רעש אור העירור
אור תועה לא-חסום היא צורת רעש אופטי הנובעת ממקור אור העירור עצמו כמו גם מאור הסביבה מסביב למכשיר, ואיננו נובע מהדגימה או מקורות אוטו-פלואורסנציה אחרים. אור בלתי חסום ממקור העירור עלול להוות דאגה משמעותית, מאחר שחלק גדול (אחוזים בודדים או יותר) של אור העירור המופנה אל הדגימה מוחזר מהלוחית של המיקרוסקופ, כיסוי או זכוכית אחרת המשמשת לתמיכת הדגימה והמופנית חזרה אל נתיב הפליטה. אור תועה מתאורת החדר איננו מהווה בעיה משמעותית עבור המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית הקונפוקלית, בשל העובדה שמשתמשים בנקבים בעלי קוטר קטן. אולם, יש למזער מקור זה של רעש אופטי ביישומי מיקרוסקופיה כאשר לא משתמשים בנקבים, כגון במיקרוסקופיה רחבת-שדה ומרובת-פוטונים. ניתן למזער רעש אופטי הנובע מהחזרות אור תועה מחוץ לאופטיקה הפנימית באמצעות תכנון מערכת קפדני והוספת הטלות אלומה כנדרש. ביישומי הדמיה רבים רמת האור התועה מוקטנת בהשוואה לרעש פלואורסנציית הרקע וברוב המקרים אפשר להתייחס אליו כערך קבוע שניתן לקבוע אמפירית. אולם, עבור ריכוזים נמוכים של פלואורפורים, במיוחד ביישומים כגון הדמיה חד-פרודתית, הוא עשוי להיות משמעותי ודורש שיקול מעמיק במיוחד כאשר בוחרים מסננים.

מאחר שהמקור המשמעותי ביותר של רעש אור תועה לא חסום הוא ככלל מקור אור העירור בעצמו, אנחנו מעריכים כאן את גודל תרומה מיוחדת זו לרעש האופטי הכללי. בהתאם לנוסחאות דלעיל, עצמת רעש אור העירור (בגלאי) ניתנת לביטוי מתמטי כ:

כאשר fE הוא גורם אמפירי המוכנס כדי להתחשב בכמות האור המוחזר המכוונת מחדש מנתיב הגירוי אל נתיב הפליטה (בעיקר על-ידי החזרה מהדגימה והזכוכית התומכת). ערך טיפוסי עבור fE יכול להיות 0.04~ (כלומר 4% החזרה), המייצג את כמות האור המוחזר מלוחית זכוכית נקייה של מיקרוסקופ. אולם, ערך זה נקבע גבוה יותר כדי להביא בחשבון החזרות ספקולריות אחרות הנוצרות מהדגימה ומהסביבה שמסביבה. אות הרעש האור המעורר NE מחושב על-ידי אינטגרציה של העצמה התלויה באודך-הגל IE(l) על-פני כל אורכי-הגל:

יכולת החסימה של מסנני ההפרעות דקי-שכבה היא הנשק העיקרי כדי למנוע את האור התועה המוחזר להגיע לגלאי. המסננים עובדים יחד בצורה משלימה כך שמכפלת ספקטרומי המסננים (במיוחד ספקטרומי העירור והפליטה) במשוואה הנ”ל צריכה להיות נמוכה מאוד בכל אורך-גל בו עצמת מקור האור ו/או היענות הגלאי הן משמעותיות. מסננים בעלי יכולת חסימה מוגבלת מביאים לרמות עולות של אור עירור תועה המגיע לגלאי ולבסוף מקטינים את נאמנות התמונה. לכן, דרוש שיקול קפדני כדי לבחור את המסננים המתאימים הבוחרים ספקטראלית את האור הרצוי עם העברה גבוהה ומונעים אור מחוץ-לתחום על-ידי הספקת חסימה משופרת ברמות צפיפות אופטית (OD) גבוהות. דוגמה של מסנן בעל העברה גבוהה וחסימה גבוהה מובאת באיור 3 להלן.
רעש פלואורסצנטיות רקע:
רעש פלואורסצנטיות רקע יכול להיגרם מאוטו-פלואורסצנטיות כמו גם מקישור לא-ספציפי. אוטו-פלואורסצנטיות נתפסת לרוב כפלואורסצנטיות הנובעת מחומרים אחרים מאשר הפלואורופורים בעלי עניין. אם כי לעתים בעייתית, האוטו-פלואורסצנטיות יכולה לשמש  לגילוי המינים הביולוגיים. תאים המכילים פרודות דוגמת ה-pyridine (NAD, NADP) ו-flavin (FMN, FAD), הפולטים פוטונים פלואורסצנטיים כאשר הם מעוררים על-ידי אור נראה או אולטרא-סגול, יכולים לשמש ככלי אבחון חשובים. מידע שימושי מהאוטו-פלואורסצנטיות של NADH יכול לשמש לניטור המצב המטבולי של רקמות חיות. אולם, אם לא מתכוונים ספציפית לאותות אלה, האוטו-פלואורסצנטיות ממינים אלה  וממינים אחרים היא בעיה שיש לטפל בה.
אוטו-פלואורסצנטיות של דגימה נובע מהסביבה בה מובנה חלק המטרה של הדגימה. במקרה של דגימות ביולוגיות, היא נובעת לרוב מהעצמה הגבוהה של פרודות אורגניות, כגון NADH ופלאבינים המגלים פלואורסצנטיות באותם תנאי הארה. היא שואפת להיות נמוכה יותר באורכי-גל ארוכים יותר, ופלואורופורים קרובים-לאדום (NIR) פותחו כדי לנצל תכונה זו. אך פיתרון זה איננו מתאים תמיד מאחר שפלואורפורים רבים בעלי תכונת ביו-כימיות רצויות מעוררים בצורה עדיפה ומוצגים בתחום אורך-הגל הנראה. הוכחו אמצעים אחרים כדי להגביל בצורה ניסיונית ולמנוע אוטו-פלואורסנטיות. לאחרונה Neumann  ו-Gabel דיווחו על צמצום אוטו-פלואורסצנטיות הדגימה הנצפית בהדמיה פלואורסצנטית של רקמות עצבים הקבועים על-ידי אלדהיד. הגישה שלהם הייתה להקרין את דגימת הרקמה תוך שימוש במנורת קשת כספית לפני הצביעה [3]. על-ידי הארת דגימות במשך כ-20 דקות, הם מצאו שניתן לבטל את האוטו-פלואורסצנטיות באזור המואר. אם כי מסקרנת, הגישה של מינון אור (לפני ההדמיה) כדי להקטין את האוטו-פלואורסצנטיות איננה רצויה תמיד, במיוחד עבור הדמיה של תאים חיים או עבור דגימות הרגישות לנזק הנגרם על-ידי האור.
אוטו-פלואורסצנטיות ללא-דגימה יכולה לנבוע מכל מרכיב אחר בנתיב האופטי דרכו מופץ האור, כגון אובייקטיב של מיקרוסקופ, מסננים אופטיים וכל זכוכית אחרת התורמת לתמיכת הדגימה. ככלל, מסננים משתמשים במצעי אוטו-פלואורסצנטיות נמוכה כדי למזער את מקור הרעש, אך סוגי הזכוכית המשמשים באובייקטיבים של מיקרוסקופים חדישים הם יותר מאולצים, ולכן עשויה להיות אוטו-פלואורסצנטיות ניכרת מאובייקטיב המיקרוסקופ.
במצבים רבים, התוצאה המקובלת ביותר של אוטו-פלואורסצנטיות היא עלייה בלתי-רצויה הניתנת למדידה באות האור אשר קשה למנוע ומאתגר לשלוט בו. האוטו-פלואורסצנטיות מפריעה ומסתירה את הגילוי של פלואורסצנטיות המופקת על-ידי חומרי הזרחן הנוגעים, דבר המקשה על גילוי אותות פלואורסצנטיות חלשים. אוטו-פלואורסצנטיות פוגעת במיקרוסקופיה פלואורסצנטית חד-ערוצית ודורשת תשומת-לב ניכרת, במיוחד כאשר מבקשים תוצאות כמותיות (לדוגמה בהדמיה רציומטרית). במקרה של הדמיה רב-ערוצית בניסויים בעלי תגים כפולים ומשולשים, קריטי לקבוע את רמת האוטו-פלואורסצנטיות של הרקע בנפרד בכל ערוץ, מאחר שעשויים להיות הבדלים משמעותיים ברמות האוטו-פלואורסצנטיות הקיימות בכל ערוץ.
ניתן לבטל את האוטו-פלואורסצנטיות על-ידי הפרדה (unmixing) ספקטראלית [4]. הפרדה ספקטראלית היא טכניקה מתמיטית המשמשת לקביעת כמות הספקטרומים של מרכיב מסוים מתוך ספקטרום מדוד המכיל את כל המרכיבים. היא מצליחה ביותר כאשר החתימות הספקטראליות של האות(ות) הרצוי כמו גם אותות אור בלתי-רצויים אחרים ידועים או שניתן להסיק אותם מהנתונים המדודים. המשימה המתמטית נעשית יותר מורכבת ומאתגרת חישובית אם אותות אור רקע בלתי-רצויים אינם ידועים היטב ולא נקבעים בקלות.
רעש פלואורסנציה הנובע מקשירה לא-ספציפית הוא מאוד קל להבנה, אם כי לעתים קשה לבטלו. יש למטב את פרוטוקולי הכנת הדגימות  כדי למזער את כמות פרודות הפלואורופור שאינן קשורות כימית למיני המטרה בדגימה.
ניסויי בקרה מבוצעים היטב יכולים לספק נתונים כמותיים ישירים שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע ולהבחין בין אוטו-פלואורסנציה ותרומות קשר לא-ספציפיות אל אות הפלואורסצנטיות הכולל. אם כי צורכת זמן, גישה זו חשובה ורצוי לעקוב אחריה, במיוחד בשל התנאים המשתנים לרוב מניסוי לניסוי.

*הכתבה נמסרה באדיבות חברת להט טכנולוגיות